| Sıra | DOSYA ADI | Format | Bağlantı |
|---|---|---|---|
| 01. | Koinfeksiyonlarda Moleküler Tanı Yöntemleri Ve Klinikte Kullanımı. | pptx | Sunumu İndir |
Transkript
Doç. Dr. Murat SayanKocaeli Üniv. Araşt. Uyg. Hast.sayanmurat@hotmail.comMobil: 0533 647 9020Koinfeksiyonlarda moleküler tanı yöntemleri ve klinikte kullanımı.UVHS III 24-26 Mayıs 2013Girne, KKTC
Soriano V. Antiviral Research 2010; 85(1): 303-315 Küresel koenfeksiyon durumu (milyon)HIV + HCV HIV + HBV
HastaViral hepatit koinfeksiyonuAntiretroviral tedavi durumuHIV-1 subtip1 HBV DNA (+) Tedavi B2 HBV DNA (+) Tedavi B3 HBV DNA (+) Tedavi B4 HBV DNA (+) Tedavi B5 HBV DNA (+) Tedavi CRF12_BF6 HBV DNA (+) Tedavi F17 HBV DNA (+) Naif CRF12_BF8 HBV DNA (+) Naif CRF02_AG9 HBV DNA (+) Naif B10 HBV DNA (+) Naif CRF02_AG11 HBV DNA (+) Naif CRF02_AG12 HBV DNA (+) Naif B13 HBV DNA (+) Naif B14 HBV DNA (+) Naif F115 HBV DNA (+) Naif F116 HBV DNA (+) Naif B17 HBV DNA (+) Naif CRF12_BF18 HBV DNA (+) Naif B19 HBV DNA (+) Naif B20 HBV DNA (+) Naif CRF02_AG21 HBV DNA (+) Naif B22 HBV DNA (+) Naif CRF12_BF23 HBV DNA (+) Naif B24 HBV DNA (+) Naif B25 HBV DNA (+) Naif CRF02_AG26 HCV RNA (+) Tedavi B27 HCV RNA (+) Tedavi B28 HCV RNA (+) Naif CRF02_AG29 HCV RNA (+) Naif CRF01_AETablo1. Ülkemizde HIV-1 pozitif hastalarda HBV/HCV koinefsiyonuHIV-1 + HBV; 25/29 (%86)HIV-1 + HCV; 4/29 (%14)
Virus HIV HBV HCVGenom RNA DNA RNAMutasyon sıklığı Çok yüksek Yüksek Çok yüksekGünlük viral üretim 1010 1013 1012Viral genetik arşiv Evet Evet Hayırİlaç hedefleri Çoklu Tek ÇokluKesin tedavisi Yok (entegre viral DNA)Yok (cccDNA)OlabilirTedavinin amacı Hayatboyu süpresyonHayatboyu süpresyonKür: Plazma + KC'in HCV’den temizlenmesiHIV, HBV ve HCV
Subsitutsiyon/bölge/yılMutasyon/genom/ replikasyon siklusuÖkaryot 10-8–10-9 0.01Bakteriler ve DNA virusları10-7–10-9 0.003RNA ve ssDNA virusları10-3–10-4 1Richman D. EASL HBV-HCV resistance monothematic meeting. February 14–16, 2008. Paris, France.Mutasyon sıklığı: ökaryot/virus kıyaslama
Neden viral varyantlar ve/veya türümsüler oluşmaktadır.• Hergün 1011 virion üretilip atılmaktadır.• Bir kronik HBV taşıyıcısında, sirkülasyondaki HBV konsantrasyonu: 108 - 1010 virion/ml• Bayesian kestirimine göre HBV genomunda 1/10 000 nükleotidlik (subsitutsiyon/bölge/yıl) değişim olmaktadır.• Bu yüksek değişim sıklığının anlamı HBV genomundaki her bir nükleotidin her gün değişebileceğidir.Locarnini S. Clinics in Liver Diseases. p439-459
• Tek viral hedef: HBV polimeraz• Kısıtlı antiviral seçenekler: Nükleoz(t)id analoglarıHBV ilaç direnci, HIV’e göre daha büyük bir problemdir.X
Yeni HCV tedavilerinde antiviral ajanlar, dirençli varyantların seçilimine neden olabilir.Soriano V. Antiviral Research 2010; 85(1): 303-315
845 a.a.TerminalproteinSpacer Pol/RT RNaseHA B C EDYMDDGVGLSPFLLAI(G) II(F)rtL80V/I rtM204V/I/SLAMrtV173LrtL180MrtA181T/V rtN236Trtl233V ADVrtM204V/IrtS202G/C rtM250I/VrtT184S/A/I/L ETV rtL180M TDF* rtA194TrtA181T/VrtL80V/I rtL180M rtM204ILdTrtN236THBV’nin oral antivirallerle tedavilerinde genellikle saptadığımız ve primer ilaç direncinden sorumlu mutasyonlarTakkenberg RB. Vox Sanguinis 2009 Nov 25. [Epub ahead of print]
Viral breakthrough, her zaman ilaç direnci anlamına gelmemektedir.Gelişen bazı mutasyonlar (kompansatuvar) HBV’nin replikasyon kapasitesini onarıcıdır.Sheldon J. J Antimicrob Chemoth 2008; 61: 766–768. Zoulim F. Gastroenterology. 2009;137(5):1593-608 Genellikle saptadığımız kompansatuvar mutasyonlar: LAM: L80V/I, Q149K, L169T, Q215P/S ADV: L80V/I, V84M, S85A, V214A, Q215P/SLdT: L82M, L91, L229, A200V
Mutant viral kökenleri saptama yöntemleri;• major (>10%), orta ve minor (<1%) viral populasyonlarChevaliez S, et al. Gastroenterology. 2012 May; 142(6): 1303–1313.e1.
Çoklu ilaç dirençli HBV varyantları saptanabilir.• Kural: Farklı sınıftan en az iki nükleoz(t)id analoğuna, çapraz olmaksızın direnç saptanmalıdır.Papatheodoridis GV. Future Microbiol 2008; 3(5):525-538
M.Sayan, et al. Multidrug – resistant hepatitis B virus strain in a chronic Turkish patient: A case report. Hepatitis Monthly 2010;10(2):141-146Sequential NUCs therapyResistance detection methodPrimary resistance Compensatory resistance Resistance toLAM Direct sequencing(13th month)M552V (rtM204V) L528M (rtL180M),V555V (rtV207V)LAMLAM + ADV NT NT NT -ADV LIPA(11th month)rtN236T - ADV,TDF (intermediate)ADVClonal analysis (on 6 clones) (11th month)rtM204I rtA181V rtL80V LAM, ADV, LdT,ADV + ETVDirect sequencing(5th month) - rtQ215H -ETV Direct sequencing(18th month) tM204V rtV173L, rtL180MLAM ,ETV (intermediate) ETVLIPA(18th month)rtM204V, rtN236T,rtA181V/T rtV173L, rtL180M, rtL80I/VLAM, ADV andTDF (intermediate)ETV + TDFDirect sequencing(4th month)rtM204V rtV173L, rtL180MLAM andETV (intermediate)ETV + TDFLIPA(4th month)rtM204V rtV173L, rtL180MLAM andETV (intermediate)ETV + TDFClonal analysis (on 5 clones)(4th month)rtM204V rtV173L, rtL180M LAM andETV (intermediate)Ardışık monoterapi çoklu HBV ilaç direnci yaratabilir.
Shepard CW, et al. Lancet Infect Dis 2005;5:558-67. Kramvis A, et al. Vaccine 2005;23:2409-23.HBV genotiplerinin küresel dağılımıÜlkemizde HBV genotip/subgenotip analizileri yapılmalı mıdır?
HCV tedavilerinde önemli bir terminoloji:• EASL HCV kılavuzu: 2.4. The current standard of care and developing therapies., p 246:The primary goal of HCV therapy is to cure the infection, which results in eliminating detectable circulating HCV after cessationof treatment. • Sustained virological response (SVR), is defined as an undetectable HCV RNA level (<50 IU/ml) 24 weeks after treatment withdrawal.• 4.4.2. HCV RNA detection and quantification, p 249, Recommendation:• HCV RNA detection and quantification should be made by a sensitive assay (lower limit of detection of 50 IU/ml or less), ideally a real-time PCR assay, and HCV RNA levels should be expressed in IU/ml (C1).• Saptanamaz HCV RNA seviyesi: Kullanılan tanı testinin saptama sınırlarının altında kalan HCV RNA yüküdür. • Bu seviye “negatif” olmak zorunda değildir.
HCV RNA kantitasyonunda saptama sınırı daha da aşağıya çekilmeli midir?• < 20 - < 25 IU/ml• < 10 - 15 IU/ml
İlaç direncini ne zaman belirleyelim?
Doerig C. Rev Med Suisse 2009; 5:203 - 208Kronik hepatit B’de önce ilaç direnci mutasyonları oluşur.
Kronik hepatit C’de NS3 inhibitörleri ile tedavi başarısızlığında, yüksek oranda ilaç direnci oluşmaktadır. Dirençli varyant Doğal tip Veri yokVirolojik alevlenme görülen hastalar(n=125)Relaps görülen hastalar (n=90)A total of 215 of 1,169 patients treated with a T12/PR regimen in a Phase 3 clinical trial had on-treatment virologic failure (n = 125) or relapse (n = 90). Results based on population sequencing analyses of HCV in these 215 patients.Faz III klinik aşamada, telaprevir tedavisi altındaki hastalarda, ilacın eksikliğinde saptanan HCV varyantları :
Telaprevir Faz III çalışmaları: tedavi başarısızlığının ardından dirençli varyantların tespit edilme olasılığı• Popülasyon dizi analiziyle doğal tip oluşumuna kadar geçen medyan süre: 7 ay (%95 CI: 5 - 8)Doğal tip olma olasılığı10.00.10.20.30.40.50.60.70.80.91.0Olasılık0 2 4 6 8 10 12 14 16 18Tedavi başarısızlığından sonra geçen süre (ay)Tedavi başarısızlığı sırasında dirençli varyantlara sahip olan hastaların %’si%74 (289/388)Sullivan JC, et al. J Hepatol 2011;54(Suppl. 1):S41Popülasyon dizi analizi kullanılarak elde edilen Kaplan-Meier tahminlerine dayanmaktadır; medyan
Tedavi naifBilgi yoksaKesilmiş tedaviBaşarısız tedaviBaşlangıç Hayır* Hayır* Hayır* EvetPrimer tedaviye yanıtsızlık (3. ay) Evet# Evet# Evet# -Sekonder tedaviye yanıtsızlık Evet Evet Evet -*Örnekleme yapılmalı (tedavi başarısızlığının kanıtlanması gerektiğinde paralel çalışmada kullanmak üzere). # Hasta tedaviye bağlı kalmış isePawlotsky JM, et al. Gastroenterology 2008;134:405-15.Keeffe EB, et al. Clin Gastroenterol Hepatol 2007;5:890-97.Primer yanıtsızlık: (>104 kopya/ml) Suboptimal yanıt: (300-104 kopya/ml)HBV ilaç direnci testleri: Ne zaman?
İlaç direncini nasıl belirleyelim?
İlaca dirençli HBV dizinlerinin belirlenmesiGenotipik yöntemler ─ DNA dizi analizi· PCR ürünlerinin dizi analizi· Klonlanmış varyantların dizi analizi─ Line probe assay (LIPA)─ PCR-RFLP─ Real-Time PCR• Matrix-assisted laser desorption/ionisation-Time of light Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS)Fenotipik Yöntemler─ Hayvan hepadnavirus modelleri─ Transfeksiyon temelli modeller─ Hücreden yoksun enzim deneyleriBozdayı M. Viral Hepatit 2009. s53
LIPA; bilinen HBV primer ilaç direnci mutasyonlarını doğal tip motiflerle birlikte gösterir (v2, v3…)
DNA dizi analizi• Analitik duyarlılık: mutant virus populasyonu >%10 ise başarılı• HBV DNA seviyesi: >500 IU/ml de başarılı• Potansiyel yeni mutasyonları belirlemek mümkün• Pol geninde geniş bir bölgeyi analiz etmek mümkün• Aynı anda S gen bölgesini analiz etmek mümkün• Elde edilen diziyle HBV genotipleme, subgenotipleme ve rekombinasyon analizleri yapmak mümkün.Woo HY. Antivir Ther 2007;12:7-13. Alignment, baz atama, data analizi ve raporlama54321 SerumHBV pol geni sekanslama ABI 3130 sekans analizörü Applied Biosystem (70 dk)Saflaştırma, forward primer ile sekans PCR’ı (60 dak)DNAizolasyonu PCR Sekans PCR
HCV NS3 ve NS5 inhibitör direnci• Direkt (populasyon) sekanslama yöntemi;– RNA izolasyonu– cDNA yapımı– HCV PCR (nested)– PCR ürün saflaştırma– HCV proteaz/RT sekanslama– Analiz ve raporlamaAnaliz edilen bölgelerREVERS TRANSKRIPTAZ (RT): kodon: 2421-3012PROTEAZ : kodon: 1027-1658
Direkt sekanslama Pyrosekanslama ya da Ultra deep sekanslama Line probe assay Klon analizi RFLPTeknik Populasyon sekanslama Yeni nesil sekanslama (Sanger sonrası)Oligonukleotid probla hibridlemePCR ürün klonlaması PCR ve kesilmiş uzunlukta polimorfizm analiziDuyarlılıkSekans içeriği ve hedef bölgenin ikincil yapılarından etkilenebilir. Minör subpopulasyon kaçırılabilirSekans içeriğinden ve hedef bölgenin ikincil yapılarından etkilenebilirMinör subpopulasyon kaçırılabilirSekans içeriğinden etkilenebilirMinör subpopulasyon kaçırılabilirAnalitik duyarlılıkMutant varyant oranı > %10 olmalıMutant varyant oranı > %1 olmalıMutant varyant oranı > %5 olmalıAnalitik duyarlılık sorunu yokMutant varyant oranı > %5 olmalı Özgüllük Hatalı sinyaller okunabilir Hatalı sinyaller okunabilir Yeni mutasyonlar için yeniden dizayn gerekiyorHatalı sinyaller okunabilir Yeni mutasyonlar için yeniden dizayn gerekiyorMutasyon tanımlamaBilinen ve potansiyel tüm yeni mutasyonlar analiz edilebilirBilinen ve potansiyel tüm yeni mutasyonlar analiz edilebilirSadece ticari olarak sunulan mutasyonlar analiz edilebilirBilinen ve potansiyel tüm yeni mutasyonlar analiz edilebilirBilinen mutasyonlar analiz edilebilir.KullanılabilirlikSaflaştırılmış ve yeterli PCR ürünü gerekiyor (Viral yük > 1000 IU/ml)Saflaştırılmış ve yeterli PCR ürünü gerekiyor (Viral yük > 1000 IU/ml)Yeterli PCR ürünü gerekiyor (Viral yük >200 IU/ml)Yeterli sayıda klon gerekiyor(Viral yük > 1000 IU/ml)Restriksiyon enzim setleri gerekiyor(Viral yük > 1000 IU/ml)Maliyet Düşük/kabul edilebilir Yüksek Yüksek Yüksek DüşükZorluk derecesiZaman alıcı, pahalı donanım ve ileri deneyimli personel gerekmekteZaman alıcı, pahalı donanım ve ileri deneyimli personel gerekmekteİleri deneyimli personel gerekmekteZaman alıcı, pahalı donanım ve ileri deneyimli personel gerekmekteZaman alıcı ve ileri deneyimli personel gerekmekteRutin olarak; Uygun Uygun Uygun Uygun değil Uygun değilEdinme Manuel Manuel/Ticari Ticari Manuel ManuelTablo 1. Oral antiviral ilaç direnci analizlerinde kullanılabilecek metodların karşılaştırılması Sayan M. Molecular diagnosis of entecavir resistance. Hepatitis Monthly 2010; 10(1): 42-47
SUT, Mayıs 2013.PCR testlerinde düzenleme yapıldı. Bünyesinde Ruhsatlı Genetik Tanı Merkezi bulunan 3.basamak kurumları sadece 9.C kodlarını (DNA sekanslama, rela-time PCR, revers transkriptaz PCR, multiplex PCR…….) kullanabilecek.4809 9.A- MOLEKÜLER MİKROBİYOLOJİ 9.C.-MOLEKÜLER TETKİKLERArtık fatura edemeyeceğimiz analizler4810 908.120 Candida PCR F.tularensis PCR4811 908.130 Chlamydia PCR BK Virus PCR4812 908.140 CMV PCR JC Virus PCR4813 908.150 HBV-DNA, kantitatif IL 28B polimorfizm4814 908.160 HCV genotiplendirme Adenovirus PCR4815 908.170 HCV-RNA, kantitatif Adenovirus tiplendirme4816 908.171 HDV-RNA, kantitatif Enterovirus PCR4817 908.180 Helicobacter PCR Parechovirus PCR4818 908.190 Hepatit G PCR VZV PCR4819 908.200 Herpes PCR (Her biri) EBV PCR4820 908.210 HIV PCR Ureaplasma PCR4821 908.220 HIV RNA, kantitatif HPV genotiplendirme4822 908.230 Human papilloma virus (HPV) HBV genotiplendirme4823 908.240 Hücre siklusu ve DNA paneli HBV ilaç direnci analizi4824 908.250 İnsitu hibridizasyon ve insitu PCR tetkikleri, test başına HCV ilaç direnci analizi4825 908.280 Legionella PCR HIV-1 ilaç direnci analizi4826 908.290 Mikobakteri (PCR) HIV-1subtipleme4827 908.300 Mikobakteri tiplendirilmesi (PCR) Atipik mikobakteri tiplendirme4828 908.310 Moleküler analiz öncesi lökosit alt grup saflaştırma, her bir grup 4829 908.320 Mycoplasma PCR 4830 908.330 Parvovirus PCR 4831 908.340 PCR-mikrowell hibridizasyon yön. İle BOS'da CMV sap. 4832 908.350 PCR-mikrowell hibridizasyon yön. İle BOS'da EBV sapt. 4833 908.360 PCR-mikrowell hibridizasyon yön. İle BOS'da HSV-1 sapt. 4834 908.370 PCR-mikrowell hibridizasyon yön. İle BOS'da HSV-2 sapt. 4835 908.380 PCR-mikrowell hibridizasyon yön. İle BOS'da HV-6 sapt. 4836 908.390 PCR-mikrowell hibridizasyon yön. İle BOS'da VZV sapt. 4837 908.400 Transformasyon Con A ile 4838 908.410 Transformasyon PHA ile 4839 908.420 Transformasyon PPD ile 4840 908.430 Transformasyon tetanoz toksini ile
S C
Koinfeksiyonlarda Moleküler Tanı Yöntemleri Ve Klinikte Kullanımı.
Yazar :
Murat Sayan
Yıl : 2013
Anahtar Kelimeler
Daha fazla görüntüle