| Sıra | DOSYA ADI | Format | Bağlantı |
|---|---|---|---|
| 01. | Enfeksi̇yon Hastaliklarinda Tani | ppt | Sunumu İndir |
Transkript
Enfeksiyon hastalıklarının mikrobiyolojik tanısı İsmail Ceyhan
Öğrenme hedefleri • Enfeksiyon hastalıklarının tanısında direkt ve dolaylı mikrobiyolojik testler • Boyalı mikroskobik inceleme • Kültür • Sero-immünolojik testler • Moleküler incelemeleri (PCR) Bu dersin slaytları öğrenim amaçlı kişisel kullanım içindir. Sununun tamamı veya bir kısmı sözlü ve/veya yazılı hiçbir şekilde herkese açık araçlarda paylaşılmamalıdır. Eylem telif haklarının ihlali olarak değerlendirilebilir.
Mikrobiyolojik testler İnfeksiyon hastalıklarında kesin tanı hastalığın etkenine yönelik olan mikrobiyolojik testlerle konur. Bunlara spesifik = özgül testler denir. İki grupta incelenirler.
Mikrobiyolojik testler 1-Direkt mikrobiyolojik tanı yöntemleri Hastadan alınan uygun hastalık örneğinde infeksiyon hastalığının nedeni olan etken mikro- organizmayı ortaya çıkarmak, üretmek ve onun hastalandırıcı etken olduğunu kanıtlamak 2-Dolaylı mikrobiyolojik tanı yöntemleri İnfeksiyon hastalığının seyri sırasında, etken mikrobun antijenlerine karşı, organizmada oluşan özgül immün cevabı ortaya çıkarmak
Mikrobiyolojik testler
Mikrobiyolojik testler Enfeksiyon hastalıkların tanısı ve tedavisi, etken olan mikroorganizmanın tanımlanmasını gerektirir. Örneklerin alınması ve laboratuvara ulaştırılmasında kurallar
Mikrobiyolojik testler Örneklerin alınması ve taşınmasında kurallar İlaç başlanmadan önce veya kontrol amacıyla antibiyotik kesildikten 48 saat sonra alınmalıdır Aseptik koşullarda alınmalı normal floraya dikkat edilmeli Etkilenen bölgeden Uygun zamanda ve yeterli miktar tifoda birinci hafta kan kültürü, daha sonra dışkı kültürü Uygun taşıma besiyeri içinde, ya da uygun kaplarda En hızlı şekilde Gerekli durumlarda +4°C’desaklanabilir.
Mikrobiyolojik testler Örneklerin alınması ve taşınmasında kurallar Hastalık ile ilgili örnek İshalde dışkı, akciğer enfeksiyonunda balgam,tonsillitte boğaz örneği alınması gibi. Yapılacak test/istek belgesi ve örnek bilgilerinin kap üzerine etiketlenmesi Öneklerin hemen işleme alınması
Mikrobiyolojik testler 1-Mikroskopik inceleme Hızlı tanı Hassasiyeti ve özgüllüğü düşük (Plasmodium) gibi özellikli incelemelerde birden fazla ve özel boyalar gerekebilir. 2. Kültür Canlı mikroorganizma içermelidir
Mikrobiyolojik testler 3. Mikrobiyal antijenin aranması Elimizdeki belirli antikorları içeren bağışık serumlardan yararlanarak klinik örneklerde mikroorganizmalara ait antijenleri araştırmak Uygun örneğin seçimi patojene bağlı kriptokok menenjiti için beyin omurilik sıvısı (BOS), Legionella pneumonia için bronko-alveolar lavaj (BAL) veya idrar
Mikrobiyolojik testler 4. Serolojik testler (sero-immünoloji); Elimizdeki bilinen bir mikroorganizma antijenlerini kullanarak insan serum ve diğer vücut sıvılarında antikor araştırmak. Örnek alımı (kan) antikorların pik yaptığı dönem ya da önemli bir artış gösterdiği dönem gibi uygun zamanlarda alınır.
Mikrobiyolojik testler 5. Moleküler testler; Mikroorganizmaya ait nükleik asitleri araştırmak, tanı koymak, analiz etmek, işlemek Hibridizasyon Amplifikasyon(NAT) Sekans bazlı yöntemler Diğer moleküler yöntemler
Mikroskobik testler Doğrudan mikroskopi Doğrudan mikroskopi Örnekler uygun bir miktar SF, KOH veya lugol içinde lam-lamel arasında incelemeye alınır. 1-Boyasız mikroskopi 2-Boyalı mikroskopi
Mikroskobik testler Boyasız mikroskopi 1-Islak preparatlar Parazitlerin hareket ve morfolojisi 2-%10 luk KOH Mantar aranması için (Deri tırnak kazıntısı), dokular, proteinler erir mantar elemanları görülür 3-Lugol Dışkı örneklerinde lökosit ve parazit kislerinin ayrımında
Mikroskobik testler Boyalı mikroskopi Boyama 1-Basit boyama Tek boya kullanılır Hızlı morfolojik bilgi sağlar 2-Bileşik boyama Birden fazla boya kullanıır Bakterilerin yapısal özellikleri hakkında bigli sağlar
Mikroskobik testler Basit boyama 1-Karbol fuksin (kırmızı) 2-Kristal viole (mor) 3-Mertilen mavisi (mavi) Löflerin metin mavisi 4-Negatif gösterme siyah zeminde açık renk/renksiz Nigrosin veya çini mürekkebi 5-Mantar boyama Laktofenol Katı mantar kültürleri boyanır Mantarlar mor görülür.
Mikroskobik testler Bileşik boyama 1-Gram boyama 2-Aside dirençli boyama 3-Trikrom boyama 4-Spor boyama 5-Flagella boyama 6-Kapsül boyama 7-Gümüşleme boyama 8-Giemsa ve Wright boyama 9-PAS (periyodik asit-schiff) boyama 10-floresan boyama
Mikroskobik testler Bileşik boyama Gram boyama Bakteriyolojik temel boyama(sınıflandırma ve identifkasyon) Gram pozitif veya gram negatif Steril vücut sıvıları (BOS, idrar ) Nesseria gonorrhae (akıntı)
Image courtesy of Y tambe /Wikipedia Gram boya
Gram Pozitif Gram Negatif Gram boyama
• Gram Pozitif: Mavi-mor • Kristal viole renk • Gram Negatif: Kırmızı-pembe • Renksizleştirme işlemi sonrasında kristal viole kalıcı olamaz • Bazik fuksin/Safraninle boyanır • Gram pozitif bakterilerin kalın hücre duvarı kristal viole rengi olarak kalır Image courtesy of Y tambe /Wikipedia Gram boyama
• Bazı bakteriler Gram yöntemiyle boyanmaz • Treponema (sifiliz) • Çok ince • Mikobakteriler (tüberküloz) • Hücre duvarındaki mikolik asit/lipit kompleksleri • Mycoplasma • Hücre duvarı yok • Hücre içi bakteriler • Rickettsia (zorunlu hücre içi) • Klamidya (zorunlu hücre içi; muramik asit hücre duvarı yok) • Legionella (çoğunlukla hücre içi) Gram boyama kısıtlılıklar
•Protozoa • Plasmodium • Trypanosomalar •Hücre içi bakteriler • Chlamydia • Rickettsia • Borrelia (Bazen hücreler arası bakteriler) Giemsa boyama
Ehrlich-Ziehl- Neelsen (EZN) •Aside dirençli boyama (ARB) veya •Aside Alkole dirençli boyama (AARB) •Karbol fuksin (fenol+bazik fuksin) • Mycobacterium (özellikle TB) tanısında oldukça yaygın kullanılıyor •Ayrıca Nocardia tanısında • Modifiye ARB •Asit alkol gibi güçlü rensizleştirici maddelere direnç
Ehrlich-Ziehl- Neelsen (EZN) Image courtesy Wikipedia/Public Domain
Mikroskobik testler Bileşik boyama Aside dirençli boyama (ARB) Hücre duvarında mikolik asit Mikobakteriler, Nokardia, rodokoklar, Cryptoisospora, Cyclospora EZN, Kinyon Karbol fuksin, asit alkol, metilen mavisi Florokrom Auromin-rodamin Zemin mavi, mikroorganizmalar kırmızı
Mikroskobik testler Bileşik boyama Trikrom boyama Dışkı örneklerinde parazitler için Protozoonların kist ve trofozotleri saptamak kolaylaşır
Mikroskopik testler Bileşik boyama Spor boyama Safranin, malaşit yeşili Spor oluşturan, özellikle Bacillus veya Clostridium cinsi bakterilerin oluşturdukları spor yapıları
Mikroskopik testler Bileşik boyama Flagella boyama Hareket organeli Bakterinin hareketli olup olmadığı/kirpik varlığı görmek amacı Leifson kirpik boyası Kirpikler kırmızı renkli
Mikroskopik testler Bileşik boyama Kapsül boyama S.pneumoniae, K.pneumoniae Cryptococcus neoformans Kapsül varlığı göstermek Gümüşleme boyama Frengi etkeni T. Pallidum PAS Doku örneklerinde mantar
Mikroskopik testler Bileşik boyama Giemsa ve Wright boyama Kan örneklerinde Sıtma (Plasmodium spp), Borrelia, Riketsia
Mikroskopik testler Bileşik boyama Floresan boyama Özgül yapılara yönelik floresans boyalar Kültürde zor üreyen bakterileri Legionella, Bordetella Floresans mikroskopi
Kültür testleri Canlı mikroorganizma gerekli Uygun zamanda Antiyotik kullanılmadan önce veya kontrol amacıyla kullanımı kesdikten 48 saat sonra alınmalı Bazı hastalıklarda ateşli dönemde Uygun yerden/bölgeden Boğaz kültürü için tonsillerden Örnekler steril bir kaba alınır ve hemen laboratuvara ulaştırılır
Kültür testleri Saf kültür üretilmesi, Tanı ve ilaç duyarlılık için Uygun besiyerlerine ekim Sıcaklık, üreme süresi ve oksijen koşulları Steril örnekler;Normal flora içermeyen ve steril olması gereken örneklerinde (idrar, BOS, kan gibi) üretilen mikroplar büyük bir olasılıkla hastalık etkeni şüpesi Steril olmayan örnekler: Boğaz sürüntüsü, balgam, dışkı gibi örneklerde hastalık etkeni mikroplar, normal flora ile birlikte olabilir
Kültür testleri Kanlı agar, çikolata agar gibi genel zenginleştirilmiş besiyerleriile McKonkey, Endo vb. rutin besiyerleri Salmonella ya da Shigella için SS besiyeri Besiyerlerine ekim tek koloni düşürme yöntemine göre ekilir Oksijen toleransı: Aerop, anaerop, Fakültatif anaerob Camphylobacter ve Helicobacter’in mikroaerofilik Koloni özellikleri (S, R, M, L) Sistemik enfeksiyon yapan mantarlar, maya ve küf olmak üzere genellikle iki tür olarak Mayalar nispeten S- tipi düz ve kremsi koloniler yaparken, küfler tüyümsü koloniler yaparlar.
Kültür testleri Kan, BOS, Boğaz, İdrar Balgam, Dışkı Diğer Deri, doku, biyopsi vb.
Kültür testleri Kan Rutin aerop ve anaerop kültür için, hastanın kan alınacak kısmı önce iodin ve sonra alkol ile temizlenir. Antiseptik maddenin kuruması beklenir. Erişkinler için 10-20 ml, çocuklar için 1-3 ml kan alınıp kültür şişesinin üst kısmı alkol ile silindikten sonra kan şişeye bırakılır.
Kültür testleri Kan Sepsis, bakteremi Kan steril, Kültürde üreme etkeni gösterir Aseptik koşullarda alınmalı Normal flora etkenleri üreyebilir (kontaminasyon). %70 likizopropil alkol, %1-2 iyot tentürü/%2 klorheksidin
Kültür testleri BOS Steril Menejit etkenleri (bakteriyel), Streptokok, E. Coli, Haemophilus, Neisseria ve diğer bakteriyel etkenler Örnekler buzdolabında bekletilmez
Kültür testleri Boğaz kültürü Normal flora bakteri Bakteriyel farenjit Kültür çubuğu tükürüğe değmeden tonsil ve farenkse sürülür. A grubu beta hemolitik Streptococcus pyogenes
Kültür testleri Boğaz kültürü Kültür çubuğu tükürüğe değmeden tonsil ve farenkse sürülür. Bakteriyel farenjitli hastalardan alınan boğaz kültürü diğer patojenler için özel bir istekte bulunulmamışsa sadece Streptococcus pyogenes için yapılır.
Kültür testleri İdrar kültürü Sterildir Sistit, piyolonefrit, bakeriüri, üriner enfeksiyon Orta akım idrar Üropatojenler Gram negatif, Stafilokok Stereptokok Enterokok Mayalar
Kültür testleri İdrar kültürü Orta akım idrarı genellikle steril ya da az sayıda mikroorganizma ile geçici kontaminedir. Üretra ise fazla miktarda bakterilerle (laktobasiller, streptokoklar, stafi lokoklar) kolonizedir. İdrar örneği alınması sırasında üretradan, vajinadan ya da dışkı artıkları ile kontamine olur. Eğer idrar hemen laboratuvara ulaştırılamaz ya da bekletilir ise olduğundan fazla bakteri yanılgısı yaratır.
Kültür testleri Balgam kültürü Ağız temizlendikten sonra derin öksürük ile balgam örneği alınır. Balgamın kontaminasyonu skuamöz epitel hücrelerinin çokluğu ile tanınır. Alınan balgamda, 25’in üstünde lökosit ve 10’dan daha az epitel hücresi görülmesi kaliteli balgam olarak tanımlanır.
Kültür testleri Balgam kültürü Alt solunum yolu enfeksiyonları Tüberküloz, Pseudomanas E.coli Klebsiella Streptokok Stafilokok Asinetobakter
Kültür testleri Dışkı kültürü Dışkı alındıktan sonra 30 dk. İçinde mikroskobik incelenmesi ve kültürü yapılmalı. Kültür için eğer hemen laboratuvara ulaştırılamayacak ise Cary-Blair taşıma besiyerine alınır. Genellikle dışkıda kültür ile Salmonella, Shigella ve Campylobacter rutin olarak araştırılmaktadır. Enterohemorrhagic E. coli (EHEC, E. Coli O157:H7) için sorbitollü McConkey agar’a ekim yapılması
Mikrobiyal antijenin aranması Avantajı hızlı ve ucuz Dezavantajı bazı mikroorganizmalar için hassaslığının ve özgüllüğü düşük Genellikle doğrulama testi olarak kullanılır.
Mikrobiyal antijenin aranması S. pneumoniae pnömoni tanısı antijen aranması Legionella pneumophila için idrarda özgül antijenlerinin aranması Mantarlar için; kanda galaktomannan taranması, invazif Aspergillus aranması Beta-D- glukan testi Candida türlerinde olduğu gibi çeşitli invazif fungal enfeksiyonlarında
Mikrobiyal antijenin aranması S. pneumoniae pnömoni tanısı antijen aranması Legionella pneumophila için idrarda özgül antijenlerinin aranması Mantarlar için; kanda galaktomannan taranması, invazif Aspergillus aranması Beta-D- glukan testi Candida türlerinde olduğu gibi çeşitli invazif fungal enfeksiyonlarında
SEROLOJİ Antijen-antikor birleşmesi Özgül ve geriye dönüşümlü İkisinden birisi biliniyorsa diğeri araştırılabilir Titre artışı önemlidir
SEROLOJİ Akut hastalık dönemi ile nekahat dönemi serumları aras›nda antikor titresinde 4 kat artış saptanması geçirilmekte olan enfeksiyonu gösterir. İlk serum örneği hastalık başlar başlamaz, ikincisi ise 1-2 hafta sonra alınmalıdır. Bu çift serum örneği yararlıdır.
SEROLOJİ Tek bir serum örneğinde yüksek titrede etkene özgül IgM akut enfeksiyon IgM ve IgG’den hiçbirinin saptanmaması çok erken dönem veya enfeksiyon yok Sadece IgG saptanmı geçirilmiş enfeksiyonu
SEROLOJİ Tek bir serum örneğinde yüksek titrede etkene özgül IgM akut enfeksiyon IgM ve IgG’den hiçbirinin saptanmaması çok erken dönem veya enfeksiyon yok Sadece IgG saptanmı geçirilmiş enfeksiyonu
SEROLOJİ Viral AIDS, rotavirüs, adenovirüs, sitomegalovirüs (CMV) ve herpes virüs enfeksiyonları, viral hepatitler, infeksiyoz mononükleoz, kızamık, kızamıkçık…. Bakteriyel Bruselloz, tifo, sifiliz, leptospiroz, riketsiyoz ve tularemi…. Paraziter Amebiazis ve toksoplazmoz… Mantar Kriptokokkoz, aspergilloz ve kandidiyoz….
SEROLOJİ Presipitasyon testleri: Presipitasyon:Suda erimiş durumda bulunan antijenlerin elektrolitli ortamda özgül antikorları ile birleşerek önce bulanıklık sonra da ince granüllü bir çökme oluşturmaları Tüpte halkalı presipitasyon, jel içerisinde yayılımla presipitasyon ve elektro-immuno diffüzyon tekniğine bağlı presipitasyon yöntemleriyle hem antijen hem de antikor araştırılabilir
SEROLOJİ Aglutinasyon testleri: Agglütinasyon: Doğal olarak antijen taşıyan bakteriler, eritrositler, lökositler gibi hücreler veya yüzeylerine yapay olarak çeşitli antijenler kaplanmış eritrositler, lateks, bentonit, polistiren gibi sentetik parçacıklar, elektrolitli süspansiyon halinde iken, taşıdıkları antijenlere karşı antikor içeren bağışık serumlarla karşılaştıklarında, birbirlerine yapışarak gözle görülebilecek büyüklükteki parçacıklar halinde çökmeleri
SEROLOJİ Aglutinasyon testleri: Dolaysız aglutinasyon: Antijen veya antikorlar›n herhangi bir taşıyıcı aracılığı olmadan direkt olarak araştırlması Özgül antikorların varlında mikroorganizma antijenlerinin kümelenmesini içerir. Riketsiyoz tanısında: Weil-Felix testi, Tifo tanısında:Gruber-Widal testi Bruselloz tanısında Rose Bengal ve Wright testleri
SEROLOJİ Aglutinasyon testleri: Dolaylı aglutinasyon: (Taşıyıcı parçacıklı aglutinasyon): Bu yöntemde çözünebilir antijen eritrosit ve lateks parçacıkları gibi partiküler yapıdaki taşıyıcılara bağlanmaktadır. Bu sayede antijene partiküler bir yapı kazandırılmış olur. Böylece, eğer incelenen örnekte özgül antikor varsa gözle görülebilir bir çökme elde edilir. Bu taşıyıcı parçacıklara antikor bağlanarak antijen aranması da yapılabilmektedir.
SEROLOJİ Dolaylı aglutinasyon: Hemaglutinasyon: Taşıyıcı partikül olarak eritrositlerin kullanıldığı reaksiyon Lateks aglutinayon: Lateks parçac›klarının antijen veya antikorla bağlanması sonucunda klinik örneklerde antijen veya antikor arama yöntemi Koaglutinasyon: Staphylococcus aureus’un Cowan 1 kökeninin protein A denen yüzey proteinine, antikorların Fc kısımlarından tutunmaları sağlanarak, boşta kalan iki adet Fab kısımları ile de klinik örneklerde antijen arama yöntemi
SEROLOJİ Dolaylı aglutinasyon: Hemaglutinasyon yöntemiyle Varicella Zoster virüs (VZV), CMV, rubella ve T. gondii antijenlerini aramak için ticari kitler bulunmaktad›r. Protein antijenle kaplı eritrositler kullanılarak difteri ve tetanoz toksinlerine karşı antikorlar da araştılması Mikrohemaglutinasyon: Treponemal antikorları aramak için Lateks aglutinasyonla özellikle serum, beyin omurilik sıvısı (BOS) ve idrarda polisakkarit yapıdaki bakteri antijenleri Menenjitli hastalar›n BOS örneklerinde S. pneumoniae, N. meningitidis, H.influenza tip b, Cryptococcus neoformans ve grup B streptokok antijenleri aranabilmektedir.
SEROLOJİ Dolaylı aglutinasyon: Kompleman birleşme testleri: Antijen antikor birleşmesinin komplemanı bağlayıp aktive etmesi, aktive olan komplemanın sistemde antijen olarak kullanılan bakteri, eritrosit gibi hücrelerde sitolize neden olması esasına dayanan uygulaması zor ve zahmetli olan bir testtir. Günümüzde yerini daha kolay uygulanabilir ve daha duyarlı serolojik test yöntemlerine bırakmıştır.
SEROLOJİ Dolaylı aglutinasyon: İmmunofloresans assay (IFA): Bazı floresanlı boyalar özel yöntemlerle antikorlara bağlanabilmektedir. Bu şekilde floresanlanmış antikorlar, lamlardaki preparatlarda bulunan antijenleri ile birleştiklerinde floresan mikroskobunda floresan vererek görünür hale gelirler.
SEROLOJİ Dolaylı aglutinasyon: İmmunofloresans assay (IFA): İncelenecek materyel doku kesiti, içlerinde bakteri, mantar, virüs veya antijenlerinin bulunduğu kültürler ya da hastalık materyali olabilir. Sifiliz tanısında kullanılan floresanlı treponemal antikor absorbiyon testi (FTA-ABS), CMV, VZV, adenovirüs, influenza virüsleri, klamidya, legionella türleri vb. enfeksiyonun tanısında direkt veya indirekt floresanlı antikor testleri kullanılmaktadır.
SEROLOJİ ELISA (Enzyme Linked ‹mmunosorbent Assay) veya EIA (Enzyme immunoassay): Enzimli immun deney, antijen-antikor ilişkisini antikorlara bağlanmış bir enzimin aktivitesini izlemekle araştırma temeline dayanır. Kullanılan enzimler peroksidaz, alkalen fosfataz ve beta galaktozidaz
SEROLOJİ ELISA/EIA Uygulanması kolay, güvenilirliği yüksek, hızlı sonuç verebilen bu testler yaygın ve çok sık kullanılmaktadır.
SEROLOJİ ELISA/EIA Hepatit virüsleri, Rotavirus, EBV, Adenovirus, Herpes virüsler, CMV, human Immunodeficiency virus (HIV), Rubella, Neisseria gonorrhoae, Clamydia trachomatis, Entamoeba histolytica, T. gondii
SEROLOJİ RIA (Radioimmunoassay): Kısa ömürlü radyoizotopların (radyoaktif madde) kullanılır, çevreye ve toplum sağlına zararlı Hormon ve ilaçların serum seviyelerinin belirlenmesiyle kısıtlı Antikorları işaretleyici olarak radyoiztoplar kullanılır ve antijen antikor birleşmesi olmuşsa ortamda kalan radyoaktivite dedektörler ile ölçülür. Klinik örneklerde antijen veya antikor aranabilir.
SEROLOJİ Duyarlılık (sensitivite): Bir testin gerçek hastalar içinden hastaları bulma yeteneğidir. Yani hastalık varken testin pozitif çıkma olasılığı Özgüllük (spesifite): Bir testin gerçek sağlamlar içinden sağlamları ayırma yeteneğidir. Yani hastalık yokken testin negatif çıkma olasılığı Pozitif prediktif değer: Test pozitif iken hastalığın bulunma olasılığı Negatif prediktif değer: Test negatif iken hastalığın bulunmama olasılığı
Moleküler testler Mikroorganizmaya ait nükleik asitleri araştırmak, tanı koymak, analiz etmek, işlemek Hibridizasyon Amplifikasyon(NAT) Sekans bazlı yöntemler Diğer moleküler yöntemler
Moleküler testler Hibridizasyon Tek iplikli nükleik asit moleküllerinin tamamlayıcı gen dizileri ile (enzim veya radyoaktif işaretli prob’larla) uygun koşullar altında eşleşerek çift iplikli hibrit moleküller oluşturmasıdır. Prob:30-40 nükleotitden oluşan hedef dizinin eşleniği olarak laboratuvar ortamında hazırlanmış ve bir dedektör molekül ile işaretlenmiş oligonütleotitler.
Moleküler testler Hibridizasyon Doğrudan klinik örneklerden etkeni saptama Kültürden etkeni doğrulma A grubu streptokok farenjit, N. Gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, G. vaginalis, T. vaginalis, C.albicans
Moleküler testler Hibridizasyon İn-situ hibridizasyon: Doku, organ ve hücrelerdeki NA.belirlenmesinde Virüslerin lokalizasyonu ve latent virüsü tesbit eder(HPV,CMV) Southern- blot:DNA-DNA Northern blot:RNA-DNA
Moleküler testler Amplifikasyon(çoğaltma) NAT: Nükleik asit amplifikayon testleri Hedef NAT Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) PCR dışı çoğaltma teknikleri Sinyal amplifikasyon yöntemleri Dallanmış DNA(Branched DNA-bDNA) Hibrit yakalama testi Prob amplifikasyon Ligaz chain reaktion(LCR) Q beta replikaz amplifikasyon Döngüsel prob teknolojisi
Moleküler testler Sekans bazlı yöntemler DNA sekans analizi Line pobe assay(DNA strip teknolojisi) Pirosekanslama
Moleküler testler PCR Numunede bulunan DNA veya RNA(revers transkriptaz ile DNA’ya dönüştürülür) moleküllerinin çoğaltılarak tespit edilmesi 1-Ektsraksiyon 2-Amplifikasyon 3-Görüntüleme
Moleküler testler PCR Transkripsiyon temelli amplifikasyon, reverz transkriptaz PCR(RT-PCR): rRNA amplifikasyonu Real-Time PCR: Nükleik asit çoğaltılması sırasında flerasan sinyalin ölçülmesi Nested PCR: uzun gen dizileri içindeki daha spesifik ve kısa dizilerin amplifikasyonu Multipleks PCR: birden fazla m.o. veya m.o. farklı gen bölglerin aynı anda çoğaltılması ve tesbiti
Moleküler testler PCR Denatürasyon: DNA’nın iki ipliğin 95°’de (hidrojen bağları denatüre olduğundan) birbirnden ayrılması Bağlanma : Ortama aranan etkene ait DNA primerlerin (sentetik oligonükleotit dizileri) ve sıcaklık 55°C’ e düşürülerek primerlerin uygun kalıp DNA ile birleşmesi Uzama(elongasyon): 65-72°C’de ortalama eklenen sıcaklığa dayanıklı DNA polimeraz (Taq polimeraz) ile yeni DNA ipliklerinin sentezi (5’—3’) yönünde
Moleküler testler PCR
Moleküler testler Hibridizasyon-bDNA HBV-DNA RT-PCR HCV-DNA HCV Viral yük tayini HİV Viral yük tayini
Moleküler epidemiyoloji Etkenlerin parmak izini sürebilmek Salgın araştırması Hastane enfeksiyonları Moleküler karakterizasyonu Klononal ilişkiler genotiplendirme
Moleküler epidemiyoloji Pulsed field gel electrophoresis (PFGE): Altın standart PCR-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) Amplified fragment lenght polymorphisim DNA baz dizi analizi: Bu yöntem viral tiplendirme için altın satandart kabul edilir. Ayrıca mutasyon saptanmasında kullanılır.
Moleküler epidemiyoloji Hastane enfeksiyonu İzolatların moleküler karekterizasyonu Karbapenemaz Direnç genleri (OXA-48, NDM1, VIM, IMP, GES) Mobil genetik elementler İzolatların genotipleme rep-PCR/AP-PCR karşılaştırma Kümeleşme varsa (izolatlar aynı) PFGE ile doğrulanmalı
1.Altındiş M. “Tıbbi Mikrobiyoloji Laboratuvar Kitabı” Nobel Tıp Komisyon, 2013. 2.Us D. Başustaoğlu A. (Çeviri Editörleri) “Tıbbi Mikrobiyoloji” Pelikan Kitabevi 2013. 3. Anğ Ö. (Çeviri editörü) “ Lippincott’un Şekillerle Açıklamalı Derleme Ders Kitaplar ı: Mikrobiyoloji” Nobel Tıp Kitapları, 2018. Kaynaklar
Enfeksi̇yon Hastaliklarinda Tani
Yazar :
İsmail Ceyhan
Yıl : 2020
